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無需RNA純化，生物樣本直接qPCR—多種病原菌檢測實例

2019年，Takara發(fā)布了無需RNA提取，可直接使用生物樣本進行定量PCR的新產(chǎn)品PrimeDirect^™ Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)（Code No.RR650/651）。

點擊鏈接，了解德國科學(xué)家使用RR650構(gòu)建不需要RNA提取的快速新冠病毒qPCR檢測新方法。

下面介紹一下使用直接qPCR方法進行甲流病毒、金黃葡萄球菌、寨卡病毒檢測的實驗例。

實驗例1 甲型H1N1流感滅活病毒的檢測

我們使用PrimeDirect^™ Probe RT-qPCR Mix直接對生物樣本進行H1N1檢測。

實驗樣本

將滅活甲型流感病毒以2×10⁰-10² copies/μl的濃度加入口腔拭子樣本、鼻拭子樣本和唾液樣本中。

檢測樣本	說明
口拭子	將取樣的口拭子浸泡在200 μl PBS緩沖液中，搖勻5秒，然后向反應(yīng)液中添加1 μl上清液。
鼻腔拭子	將取樣的鼻腔拭子浸泡在200 μl PBS緩沖液中，搖勻5秒，然后向反應(yīng)液中添加1 μl上清液。
唾液	直接向反應(yīng)液中添加1 μl上清液。

反應(yīng)體系

組分	液量（μl）
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X)	12.5 μl
Forward Primer (10 μM)	0.5 μl
Reverse Primer (10 μM)	0.5 μl
qPCR probe (10 μM)	0.5 μl
樣本	1 μl
甲型流感病毒H1N1 (2×10⁰-10² copies/μl)	1 μl
RNase Free H2O	9 μl
Total	25 μl

反應(yīng)結(jié)果

擴增曲線如下圖，鼻腔拭子和唾液樣本的檢測靈敏度為20拷貝，口腔拭子樣本的檢測靈敏度為2拷貝。

實驗例2 全血中的金黃葡萄球菌檢測

實驗樣本

全血（肝素血及EDTA血）及其10倍稀釋液（PBS）中加入1×10¹～10⁵ cfu/μl濃度的金黃葡萄球菌。制備好后各使用1 μl。

引物／探針檢出范圍： 16S rRNA基因（Cy5標記）

反應(yīng)體系

組分	液量（μl）
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X)	25 μl
Forward Primer (10 μM)	1 μl
Reverse Primer (10 μM)	1 μl
TaKaRa qPCR Probe (10 μM)	1 μl
血液樣品（含金黃葡萄球菌）	1 μl
RNase Free H2O	21 μl
Total	50 μl

反應(yīng)條件

90℃	3 min
60℃	5 min
95℃	5 sec	40 Cycles
60℃	30 sec

結(jié)論

雖然使用血液成分進行檢出時有阻害，但是PrimeDirect Mix在全血原液中（肝素血、EDTA血）可直接檢出100 cfu，其10倍稀釋液也可以直接檢出10 cfu的金黃葡萄球菌。該實驗顯示，1 μl全血中如果存在100 cfu的金黃葡萄球菌，可以檢出。

實驗例3 Zika（寨卡）病毒檢測

實驗樣本

在尿液及其10倍稀釋液（生理鹽水）中，加入2×10³ copies/μl濃度的NATtrol Zika Virus（ZeptoMetrix公司）制備起始樣品，然后各使用1 μl。

引物／探針檢出范圍： Polyprotein基因（ROX標記）

組分	液量（μl）
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X)	12.5 μl
Forward Primer (10 μM)	0.5 μl
Reverse Primer (10 μM)	0.5 μl
TaKaRa qPCR Probe (10 μM)	0.5 μl
尿液樣品（含Zika virus）	1 μl
RNase Free H2O	10 μl
Total	25 μl

反應(yīng)條件

90℃	3 min
56℃	5 min
95℃	5 sec	40 Cycles
56℃	30 sec

結(jié)論

PrimeDirect Mix不易受尿原液的阻害，可直接檢出尿液中的Zika病毒。

檢測靈敏度

尿原液中分別添加濃度為2×10^-2～10³ copies/μl NATtrol Zika Virus制備起始樣品，各使用1 μl，使用上面相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

PrimeDirect Mix不易受尿液阻害，尿液中的Zika病毒2個拷貝以上即可檢出。
感染者的尿液中該病毒RNA濃度為2.1x10 copies/μl的案例也有報道，使用本試劑能夠滿足檢出靈敏度。
Zika 病毒感染者尿液中病毒RNA濃度的案例：(https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html)

我們對全血中Zika病毒檢測，也得到了類似結(jié)論。
血液成分對檢出雖然有阻害作用，但全血10倍稀釋液中的Zika病毒2拷貝以上可以檢出。顯示出在全血原液1 μl中存在20拷貝左右的Zika病毒時，可以檢出。

眾多實驗例充分證明，PrimeDirect^™ Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)（Code No.RR650/651）在直接qPCR檢測方面有著良好的表現(xiàn)，血液、尿液、糞便、細胞可以直接進行病毒或細菌的一步法RT-qPCR，大大提高了操作簡便性，減少了反應(yīng)時間，可以簡便、低成本地進行qPCR檢測。
另外，Takara基于至今為止積累的技術(shù)和經(jīng)驗，提供使用本產(chǎn)品制造基因檢測kit的定制生產(chǎn)，提供更適合的Real Time PCR檢測試劑。

從基因分析領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究到產(chǎn)業(yè)應(yīng)用，Takara將持續(xù)不斷推出各種用途的新產(chǎn)品和服務(wù)，從而進一步擴大生物產(chǎn)業(yè)支援事業(yè)。

頁面更新：2020-12-04 08:34:42

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