| 癌癥生物學(xué)研究進(jìn)展突出，體液樣本的生物標(biāo)志物分析備受關(guān)注！ | ||
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| 下一代測序（NGS）的廣泛應(yīng)用顯著地促進(jìn)了血液、尿液、唾液、胸腔積液和腦脊液（即液體活檢）中癌癥生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。利用NGS對整個(gè)基因組或數(shù)千個(gè)突變同時(shí)進(jìn)行高效測序，可以作為生物標(biāo)志物檢測和發(fā)現(xiàn)的有力工具。 | ||
| 其中，常見的體液樣本中檢測的腫瘤生物標(biāo)志物包括游離核酸（cfDNA/cfRNA）、細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）等。 | ||
| 一、游離核酸 | ||
| 游離核酸（cfDNA/cfRNA）是循環(huán)于體液中而游離于細(xì)胞外的核酸，主要是機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞程序性死亡后裂解所釋放出的DNA或者RNA。 | ||
| · cfDNA（cell free DNA） | ||
| cfDNA是體液樣本研究領(lǐng)域廣泛檢測的對象，尤其是游離在體液中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。ctDNA來源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤的特征。外周血中的ctDNA包含了癌基因/抑癌基因的突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、后生遺傳學(xué)變異等基因變異信息，現(xiàn)階段主要通過高通量測序技術(shù)檢測分析這些信息并應(yīng)用于臨床。 | ||
| · cfRNA（cell free RNA） | ||
| cfRNA，是存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中的一些內(nèi)源性或外源性微量RNA片段，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。 | ||
| 科研人員發(fā)現(xiàn)，單純的ctDNA檢測不能全面反映疾病在RNA水平的生物活性，無法明確突變對細(xì)胞進(jìn)程的影響。而RNA水平的檢測能明確癌癥在特定時(shí)間發(fā)生的變化，可定期監(jiān)控疾病的發(fā)展及對治療的反應(yīng)，并預(yù)測身患同一癌癥的不同個(gè)體將對不同療法有何反應(yīng)，因此受到廣泛關(guān)注。 | ||
| 二、細(xì)胞外囊泡 | ||
| 細(xì)胞外囊泡（EV）是細(xì)胞在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下釋放的各種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡總稱，主要由外泌體、微囊泡和凋亡小體組成，廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及血液、尿液等體液中，被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。 | ||
| 三、循環(huán)腫瘤細(xì)胞 | ||
| 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），是指從實(shí)體瘤中脫離出來并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，CTC數(shù)目往往很少。 | ||
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| Takara的可用于cfRNA、cfDNA的NGS解決方案，可以從容面對游離核酸樣本研究遇到的多種瓶頸。 | ||
| cfRNA文庫構(gòu)建 | ||
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3） | ||
| Pico v3如何解決FFPE、cfRNA樣本降解，微量建庫的難題： ① Pico v3支持250 pg-10 ng total RNA起始，即使珍貴的微量臨床樣本，也無需過于擔(dān)心樣本量不足。 ② 支持RIN2-10或DV200≥25%的RNA起始，無論是品質(zhì)較好還是高度降解的cfRNA樣本，都能生成優(yōu)質(zhì)的文庫。 ③ 創(chuàng)新性地引入了ZapR Rprobes的核糖體去除技術(shù)，無需提前處理rRNA，便可在建庫過程中識別、切斷核糖體來源的cDNA，最終能在7.5h 內(nèi)完成鏈特異性Illumina文庫的構(gòu)建。 ④ 通過添加UMI，Pico v3可以靈敏地識別PCR重復(fù)片段并校正PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤，從而進(jìn)行正確的樣本數(shù)據(jù)回溯，提供更可靠的RNA-Seq分析。 |
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| ■ 實(shí)驗(yàn)案例 | ||
| 分別使用250 pg -10 ng 的人腦部總RNA制備文庫，每個(gè)起始量2個(gè)技術(shù)重復(fù)。從下表可以看出不同起始量的情況下，測序數(shù)據(jù)非常相似。TPM≥0.1的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量超過60,000，并且保留了鏈來源信息。讀段中比對到核糖體cDNA的比例在14%到18%之間，即以250 pg 和10 ng RNA 起始制備的文庫具有高度一致性。 | ||
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| 以上數(shù)據(jù)結(jié)果也證明，微量cfRNA起始時(shí)， 使用Pico v3可以得到同樣高品質(zhì)的文庫。 | ||
| cfDNA文庫構(gòu)建 | ||
| 雖然cfDNA的應(yīng)用日趨成熟，但總有一些微量樣本無法用傳統(tǒng)技術(shù)完成高品質(zhì)文庫的構(gòu)建，特別是在進(jìn)行腫瘤早期診斷有重要價(jià)值的稀有突變分析時(shí)。 | ||
| ThruPLEX Tag-Seq HV Kit | ||
| Pico v3如何解決FFPE、cfRNA樣本降解，微量建庫的難題： ① 支持單管、三步操作，手動15 min，全程2 h，過程中無需轉(zhuǎn)管與純化，實(shí)驗(yàn)小白也能輕松上手。 ② 支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，input volume為30 μl，無需樣品濃縮。 ③ 搭配UDI建庫，ThruPLEX Tag-Seq HV可以有效降低index hopping效應(yīng)，是高通量型Illumina測序儀的“友好伙伴”。 ④ 通過添加UMI，ThruPLEX Tag-Seq HV雙端總共可有144種UMI連接到DNA分子兩端，足以正確區(qū)分是測序錯(cuò)誤還是真實(shí)的稀有突變。 |
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| ■ 實(shí)驗(yàn)案例 | ||
| Takara科學(xué)家采用ThruPLEX Tag-Seq HV 對10 ng 起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品（AccuRef）構(gòu)建文庫，該ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品帶有一系列特征化的不同頻率（0%，1%，5%）突變位點(diǎn)。文庫構(gòu)建完成后，腫瘤相關(guān)的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進(jìn)行捕獲富集。結(jié)果顯示，目標(biāo)區(qū)域的捕獲高效可靠，10 ng 起始的DNA樣本約有79%的reads來自或者接近目標(biāo)區(qū)域。 | ||
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| 隨后，Takara科學(xué)家用UMIs鑒定了ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品中特定位點(diǎn)的實(shí)際突變頻率，結(jié)果顯示，檢測到的突變頻率分別與預(yù)期1%、5%的等位突變頻率接近，而陰性對照組沒有在位點(diǎn)處檢測到任何突變。 | ||
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| （數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.） | ||
| 以上結(jié)果表明，ThruPLEX Tag-Seq HV文庫構(gòu)建系統(tǒng)，具有流程完整、快速，文庫復(fù)雜度高，結(jié)果可靠性高，兼容困難樣本等特點(diǎn)，適用于腫瘤學(xué)研究等應(yīng)用領(lǐng)域。 | ||
| 另外，Takara對產(chǎn)品進(jìn)行了升級，推出了ThruPLEX Tag-Seq HV PLUS Kit：在ThruPLEX Tag-Seq HV的基礎(chǔ)上，整合了ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Module的完整文庫構(gòu)建試劑盒。不僅保留了ThruPLEX HV的顯著功能，并且無需在文庫制備之前進(jìn)行任何機(jī)械打斷或單獨(dú)的酶切片段化處理，從而實(shí)現(xiàn)了性能和速度的充分結(jié)合。 | ||
| 經(jīng)過上述的介紹，相信大家已經(jīng)對游離核酸的建庫方案有了初步認(rèn)識，也對Takara兼容cfDNA/RNA的SMARTer、ThruPLEX技術(shù)有所了解。相信上述涵蓋微量核酸起始、兼容不同品質(zhì)核酸、操作簡便等特點(diǎn)的SMARTer、ThruPLEX技術(shù)有望助力相關(guān)實(shí)驗(yàn)開展。 | ||
頁面更新：2022-01-17 15:37:28
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