| 文獻(xiàn)分享|單細(xì)胞TCR測序：解析腎細(xì)胞癌的免疫組庫特征 |
| 前言： T細(xì)胞是獲得性免疫反應(yīng)的重要組成部分，其表面受體蛋白（T cell receptors, TCRs）發(fā)揮著識別抗原分子的作用。NGS是解析TCR多樣性的主流技術(shù)，對揭示個體獲得性免疫反應(yīng)的奧秘提供了寶貴的技術(shù)支撐。而單細(xì)胞TCR-Seq技術(shù)一方面可以直接獲得單細(xì)胞水平下克隆型的多樣性信息；另一方面也可以直接對α-β鏈配對信息進(jìn)行分析研究。本次分享的文獻(xiàn)就涉及單細(xì)胞TCR-Seq的應(yīng)用。 |
| 論文基本信息 ·論文題目：Characteristics, dynamic changes, and prognostic significance of TCR repertoire profiling in renal cell carcinoma patients ·發(fā)表雜志：The Journal of Pathology ·發(fā)表時間：2020-03-24 ·DOI：10.1002/path.5396 |
| 一、研究背景 |
| 腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的 80%～90%。腎細(xì)胞癌的病因尚不明確，其發(fā)病與遺傳、吸煙、肥胖等有關(guān)【1】。 雖然RCC被認(rèn)為是一種高度免疫原性的癌癥，但是免疫抑制時常發(fā)生。本文作者通過單細(xì)胞免疫組庫，基于SMART技術(shù)和微流控技術(shù)，探究了RCC發(fā)展不同階段和治療前后腎癌的外周T細(xì)胞的TCRB的多樣性的變化，并分析了TCRB多樣性和RCC的動態(tài)關(guān)系。 |
| 二、分析思路 |
| ★ 研究方法 |
| ·為了研究TCRB的特征，首先從45例RCC患者和2例良性腎病患者獲取87個PBMC樣本，然后提取RNA并構(gòu)建了基于SMART技術(shù)的TCRB測序文庫。共獲取到了10,072,661個TCRB克隆型，其中包括術(shù)前TCRB樣本115,428±62,953（平均±SD）個和術(shù)后TCRB樣本136,388±48,815（平均±SD）個。這里作者使用SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit構(gòu)建單細(xì)胞TCRB文庫。其中64個V基因和13個J基因均被檢測到，并認(rèn)為這種方法定量TCRB克隆型豐度是可行的。 ·為了解析TCRB多樣性的意義，對28例患者術(shù)前和術(shù)后的56個PBMC樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。 ·為了驗證結(jié)果，對一例晚期腎細(xì)胞癌患者的樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序(scRNA，微流控方法)。 |
| ★ 研究發(fā)現(xiàn) |
| ·TCRB的多樣性和Native T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)（特別是CD4-和CD8-幼稚性T細(xì)胞）。接下來，選取162個與TCRB多樣性正相關(guān)的基因進(jìn)行GO分析，其中前20個terms主要是與生物合成與代謝過程有關(guān) ；相反，GO分析結(jié)果顯示TCRB多樣性負(fù)相關(guān)的基因與炎癥反應(yīng)和凝血過程有關(guān)，特別是嗜中性粒細(xì)胞和血小板的激活。 ·結(jié)果顯示，不同的腫瘤負(fù)荷對患者免疫狀態(tài)產(chǎn)生不同的影響，四種類型的T細(xì)胞多樣性指標(biāo)一致表明良性和I期RCC患者的術(shù)前TCRB多樣性要顯著高于IV期患者； ·通過手術(shù)緩解了大多數(shù)腫瘤負(fù)荷后，IV期患者的TCRB多樣性顯著增加。結(jié)果表明，循環(huán)TCRB庫能反映患者的免疫狀態(tài)并預(yù)測預(yù)后。而且通過細(xì)胞減少腎切除術(shù)(cytoreductive nephrectomy, CN)在一定程度上減輕了晚期患者的免疫系統(tǒng)負(fù)擔(dān)，可能為免疫治療提供良好的機(jī)會。 |
| 使用的Takara產(chǎn)品：SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit |
| ■ 靈敏度高—整合SMART技術(shù)與5’RACE技術(shù)，可捕獲TRA和TRB基因完整的V(D)J可變區(qū)，用于后續(xù)NGS分析 |
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| ■ 易于使用—優(yōu)化的index允許將96個細(xì)胞混合制成12個文庫，并可以進(jìn)一步混合在一個flow-cell lane中測序 |
| 實驗孔板布局 |
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| 孔板外的陰性/陽性對照組用于測序文庫的質(zhì)量評估，孔板內(nèi)的陰性/陽性對照孔用于克隆型鑒定分析時的閾值設(shè)定以及對潛在交叉污染的評估。嚴(yán)格的質(zhì)控只為更好的測序結(jié)果。 |
| 添加SMART-Seq Indexed Oligo減少PCR偏差 |
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| 單細(xì)胞測序中涉及的文庫數(shù)量更多，將每個單細(xì)胞文庫做好標(biāo)記對下游數(shù)據(jù)分析工作而言至關(guān)重要。通過SMART-Seq Indexed Oligo，可以在轉(zhuǎn)錄本cDNA第一鏈合成時，為同一細(xì)胞來源的轉(zhuǎn)錄本添加相同“身份標(biāo)簽”—— cell barcode。這樣，孔板中同一列的8個細(xì)胞樣品都有了自己的“身份標(biāo)簽”，將它們制備成12組混合文庫進(jìn)行V(D)J區(qū)序列的擴(kuò)增，并添加上只屬于自己組內(nèi)的index標(biāo)簽序列。 |
| ■ 特異性好—完整reads，大部分reads可以比對到目標(biāo)區(qū)域，提供準(zhǔn)確鏈配對信息 |
| 實驗案例 |
| 分選到96孔板中的CD4+ T細(xì)胞參照實驗手冊標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫構(gòu)建。使用Miseq測序儀進(jìn)行測序，雙端2×300 bp reads，600 cycles。測序數(shù)據(jù)分析中，8種SMART-Seq Indexed Oligo的拆分工作通過配套的 Human scTCR Demultiplexer軟件可輕松完成。軟件下載即用，無需安裝。進(jìn)一步的序列比對、克隆型分析通過開源軟件MiXCR完成。 |
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| （數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.） |
| 至少一條TCR鏈得到鑒定的比例是92%（81/88孔），α/β克隆型的鑒定比例是65%（57/88孔），同時鑒定到α和β鏈的克隆型比例是73%（64/88孔）。 |
| 寫在最后，直接用于測序的文庫構(gòu)建流程、高效的混合測序策略、易用的數(shù)據(jù)分析軟件，SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit幫助您快速上手單細(xì)胞TCR-Seq，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)！ |
| 參考信息： |
| 【1】 腎癌診療指南（2022年版） |
頁面更新：2022-08-25 08:51:28
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