| 抗體序列的高通量快速克隆 |
| 傳統(tǒng)酶切連接的克隆方法常存在缺陷：大片段連接效率低，核苷酸缺口，缺乏方向性以及載體/插入片段制備耗時。在研究某一個抗體時，這些缺陷造成的總體工作負(fù)荷延長可能還可以接受，但擴(kuò)展至成百上千個克隆的高通量應(yīng)用時問題就比較嚴(yán)重了，因為擴(kuò)大化該工作流程就意味著擴(kuò)大其潛在問題和增加了大量的故障排除工作。 Takara的In-Fusion Cloning是一種無需連接酶、高效率的無縫克隆技術(shù)，基于載體和插入片段序列之間的同源重組原理，有助于快速、準(zhǔn)確地將任意PCR片段克隆到任意目的載體中，背景低，克隆保證方向性，單片段克隆的成功率超過95％。In-Fusion克隆的快速和易用性以及結(jié)果的準(zhǔn)確性，使系統(tǒng)可輕松應(yīng)對高通量的工作流程。 |
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| 實驗案例 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Jared L. Spidel, Morphotek, Inc.* |
| 【客戶感言】 |
| “使用In-Fusion的陽性克隆率始終高于我們使用傳統(tǒng)的酶切連接法，這使我們能夠通過省略轉(zhuǎn)化后涂板的步驟來簡化我們的工藝流程并提高產(chǎn)量。由于大多數(shù)質(zhì)粒都含有插入片段，我們可以將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)成庫并直接進(jìn)行小量制備。”——Jared L. Spidel，Morphotek，Inc. |
| 【實驗方法】 |
| 通過RT-PCR以從B細(xì)胞分離的RNA為模板擴(kuò)增可變區(qū)（V）的cDNA，其中引物在5'末端含有15 bp與信號序列或恒定區(qū)（C）同源的序列。使用In-Fusion HD克隆將V區(qū)cDNA插入片段克隆到其C區(qū)線性化載體中。轉(zhuǎn)化后，每個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物取50 μl加入到含1 ml TB的96-well深孔板中搖動培養(yǎng)過夜。對培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒提取，并進(jìn)行DNA測序以確認(rèn)所需插入片段的存在。為了確定In-Fusion克隆的效率，將甘油菌種劃線并進(jìn)行菌落PCR。 |
| 【實驗流程詳解】 |
| 以下工作流程圖只是說明In-Fusion技術(shù)如何通過手動或自動化平臺擴(kuò)展到96孔板進(jìn)行克隆的一個基本示例，盡管這個流程包括我們推薦的轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂板以確?？寺?shù)量的步驟，但在實際研究中，Morphotek公司的研究人員發(fā)現(xiàn)他們能夠完全省略這一步驟。憑借In-Fusion Cloning的高準(zhǔn)確度，他們開發(fā)了屬于自己的抗體快速生產(chǎn)高通量流程，通過另一種培養(yǎng)方法進(jìn)一步簡化了操作步驟（Spidel, J.L. et al. 2016）。 |
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| Spidel和他的同事也評估過其他的克隆方法，之所以選擇In-Fusion主要是看重了它的易用性和高陽性克隆率，這些都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的酶切連接法。借助In-Fusion技術(shù)，他們還可以實現(xiàn)無縫克隆，這是他們用Gateway克隆無法做到的。 在實驗過程中他們注意到，In-Fusion方法所具備的很高的克隆效率和“很少甚至沒有背景”的特點，使他們能夠完全省略轉(zhuǎn)化后的涂板步驟，直接培養(yǎng)轉(zhuǎn)化物得到半克隆庫。因為通常情況下，篩選單個重組克隆是克隆實驗中最耗時的部分，而In-Fusion技術(shù)使他們相信他們正在進(jìn)行正確的克隆，這樣就可以避免工作流程中的一大瓶頸，但這種方法并不適用于傳統(tǒng)的酶切連接克隆，因為酶切效率低并且需要額外的DNA操作步驟。Spidel也驗證了這種直接培養(yǎng)轉(zhuǎn)化物的方法，以確保他們實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。 |
| 【參考文獻(xiàn)】 |
| Spidel, Jared L., et al. Rapid high-throughput cloning and stable expression of antibodies in HEK293 cells. Journal of Immunological Methods 439 (2016). |
| *以上為內(nèi)容為Jared Spidel提供，僅代表個人觀點，不代表Morphotek, Inc.或Eisai Inc. 。Takara Bio并沒有為以上內(nèi)容為Jared Spidel支付報酬。 |
| 【應(yīng)用于治療熱帶疾病的疫苗】 |
| 相關(guān)產(chǎn)品 |
頁面更新：2019-11-27 14:20:20
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