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| TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) |
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| 應(yīng)用Smart Cycler II System擴(kuò)增儀的操作方法 |
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| 1. 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請?jiān)诒线M(jìn)行）。 |
| 試劑 |
使用量 |
終濃度 |
| TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2X） |
12.5 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.5 μl |
0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.5 μl |
0.2 μM*1 |
| DNA模板（<100 ng）*2 |
2 μl |
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| 滅菌水 |
9.5 μl |
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| Total |
25 μl |
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*1 通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可以在0.1～1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進(jìn)行梯度稀釋，確定合適的DNA模板添加量。如果欲使用本制品進(jìn)行2 Step RT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為DNA模板時的添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。 |
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| 2. 進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。 |
| PCR反應(yīng)管請用Smart Cycler離心機(jī)輕輕離心后放入Smart Cycler中進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，再進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應(yīng)擴(kuò)增性能較差時，可以嘗試進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請參照「實(shí)驗(yàn)條件的選擇」。 |
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| 兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序： |
| Stage 1：預(yù)變性 |
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Hold |
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95℃ 30秒 |
| Stage 2：PCR反應(yīng) |
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Repeat：40 |
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95℃ 5秒 |
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60℃ 20秒 |
| Stage 3：Melt Curve |
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◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學(xué)修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴(kuò)增效率、定量準(zhǔn)確度等都會受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進(jìn)行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
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| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。 |
反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。
使用Smart Cycler System進(jìn)行分析時，請參考儀器的操作手冊。 |
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