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TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)
 
應(yīng)用Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法
 
1. 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請在冰上進行）。
試劑 使用量 使用量 終濃度
 TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2X） 10 μl   25 μl   1X  
 PCR Forward Primer（10 μM） 0.4 μl   1 μl   0.2 μM*1  
 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.4 μl   1 μl   0.2 μM*1  
 ROX Reference Dye（50X）or
 ROX Reference Dye II（50X） *2		 0.4 μl   1 μl   1X  
 DNA模板（<100 ng）*2 2 μl   4 μl    
 滅菌水 6.8 μl   18 μl    
 Total 20 μl*4   50 μl*4    
*1 通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可以在0.1～1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 ROX Reference Dye II（50X）比ROX Reference Dye（50X）濃度低，使用7500/7500 Fast Real-Time PCR System時，請使用ROX Reference Dye II（50X）。使用ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System和 StepOnePlus 時，請使用ROX Reference Dye（50X）。
*3 在20 μl反應(yīng)體系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的DNA模板添加量。
如果欲使用本制品進行2 Step RT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為DNA模板時的添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。
*4 按照各儀器推薦體系進行反應(yīng)液配制。
 
2. 進行Real Time PCR反應(yīng)。
建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進行PCR條件的優(yōu)化。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應(yīng)擴增性能較差時，可以嘗試進行三步法PCR擴增反應(yīng)。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請參照「實驗條件的選擇」。
< Applied Biosystems 7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System >
兩步法PCR擴增標準程序：
Stage 1：預(yù)變性
  Reps：  1
   95℃    30秒
Stage 2：PCR反應(yīng)
  Reps：  40
  95℃    5秒
  60℃    30～34秒*
          Dissociation stage
* 使用StepOnePlus 時請設(shè)定在30秒。
使用7300時請設(shè)定在31秒。
使用7500時請設(shè)定在34秒。
 
< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >
兩步法PCR擴增標準程序：
Stage 1： 預(yù)變性
  Number of Cycles：    1
  95℃      30秒
Stage 2： PCR反應(yīng)
  Number of Cycles：    40
  95℃      3秒
  60℃      30秒
  Stage 3： Melt Curve
 
◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學(xué)修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5～15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
 
3. 實驗結(jié)果分析。
反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。