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| Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) |
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| 應(yīng)用Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System，StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法 |
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| 請(qǐng)按照各種儀器使用說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 |
| 1. 按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行）。 |
| 試劑 |
使用量 |
使用量 |
終濃度 |
| Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X） |
10.0 μl |
25.0 μl |
1X |
| PCR Forward Primer（10 μM） |
0.4 μl |
1.0 μl |
0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer（10 μM） |
0.4 μl |
1.0 μl |
0.2 μM*1 |
| Probe |
0.8 μl |
2 μl |
*2 |
| ROX Reference Dye（50X）*3 |
0.4 μl |
1.0 μl |
1X |
| DNA模板 |
2.0 μl |
4.0 μl |
*4 |
| dH2O（滅菌水） |
6.0 μl |
16.0 μl |
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| Total |
20.0 μl*5 |
50.0 μl*5 |
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*1 通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.1～1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
*2 使用的探針濃度，與使用的Real Time PCR擴(kuò)增儀、探針?lè)N類、熒光標(biāo)記物質(zhì)種類有關(guān)，實(shí)際使用時(shí)請(qǐng)參照儀器說(shuō)明書(shū)，或各熒光探針的具體使用要求進(jìn)行。
*3 ROX Reference Dye的反應(yīng)終濃度為1X。
*4 在20 μl反應(yīng)體系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，確定理想的DNA模板添加量。如果欲使用本制品進(jìn)行2 Step RT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為DNA模板時(shí)的添加量不要超過(guò)PCR反應(yīng)液總體積的10%。
*5 根據(jù)各儀器推薦反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整。 |
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| 2. 進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。 |
| 建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應(yīng)程序，如果該程序得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，再進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化。有關(guān)PCR的具體反應(yīng)條件請(qǐng)參照「PCR反應(yīng)條件概述」。 |
| < 7300 Real-Time PCR System > |
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兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序： |
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| Stage 1：預(yù)變性 |
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| Number of Cycles：1 |
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| 95℃ 30秒 |
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| Stage 2：PCR反應(yīng) |
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| Number of Cycles：40 |
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| 95℃ 5秒 |
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| 60℃ 31秒* |
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| < StepOnePlus Real-Time PCR System > |
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Shuttle PCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程 |
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| Fast 模式 |
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| Holding Stage |
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| Number of Cycles：1 |
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| 95℃ 20秒 |
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| Cycling Stage |
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| Number of Cycles：40 |
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| 95℃ 1秒 |
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| 60℃ 20秒 |
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◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學(xué)修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應(yīng)前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應(yīng)。如果高溫處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使酶的活性下降，其PCR的擴(kuò)增效率、定量準(zhǔn)確度等都會(huì)受到影響。如果在PCR反應(yīng)前進(jìn)行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、30秒。
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| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。 |
| 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等。分析方法參見(jiàn)儀器的操作手冊(cè)。 |
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