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無標(biāo)題文檔
PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase
高速PCR操作流程
 
1. PCR反應(yīng)液的配制。
試劑 使用量 終濃度
 5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl   1×  
 dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 μl   200 μM each  
 Primer 1 10-15 pmol   0.2-0.3 μM*  
 Primer 2 10-15 pmol   0.2-0.3 μM*  
 Template 參考最適參數(shù)的設(shè)定(3)    
 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2 μl   2.5 U/50 μl  
 滅菌蒸餾水 up to 50 μl    
   * 擴(kuò)增10 kb以上的大片段DNA時，引物的終濃度為0.2 μM。
 
2. PCR反應(yīng)條件。
   【擴(kuò)增DNA片段≦10 kb時】
            98℃         10 sec. 30 Cycles [3-step PCR]
            55℃ or 60℃*1         15 sec.
            68℃*2         10 sec./kb
   *1 Tm值（按照下面的公式計算）為55℃以上時→退火溫度設(shè)定為60℃。
       Tm值為55℃以下時→退火溫度設(shè)定為55℃。
       ※ Tm值（℃）＝[ (nA＋nT) × 2 ]＋[ (nC＋nG) × 4 ]－5
       n表示引物中堿基個數(shù)
   *2 進(jìn)行3 step PCR反應(yīng)時，也將Extension溫度設(shè)定為68℃。
   【擴(kuò)增DNA片段為10 kb-20 kb時】
              98℃         10 sec. 30 cycles [2-step PCR]
              68℃         20 sec./kb
               or
              98℃         10 sec. 30 Cycles [3-step PCR]
              60℃         15 sec.
              68℃         10 sec./kb
 
3. PCR反應(yīng)條件的選擇。
   ① 擴(kuò)增10 kb以下DNA片段時，請使用3 step PCR，不建議使用2 step PCR。
   ② 擴(kuò)增10 kb以上DNA片段時，要想縮短反應(yīng)時間，請使用3 step PCR；要想獲得高特異性擴(kuò)增，建議使用2 step PCR。
   ③ 對于GC rich模板，建議使用標(biāo)準(zhǔn)操作流程。
   ④ 無擴(kuò)增產(chǎn)物或出現(xiàn)Smear、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時，請參照Troubleshooting進(jìn)行調(diào)整。