| In-Fusion Cloning：簡單的多片段克隆解決一個合成的難題 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Christian Joerg Braun Postdoc, MIT |
| 【實驗簡介】 |
| 在該研究中，使用In-Fusion克隆將轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的多個重疊片段快速克隆到Cas9-dead病毒表達載體中。插入該結(jié)構(gòu)域的目的是改善轉(zhuǎn)錄基因激活的量。由于激活結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)，無法直接合成整個序列，并且，如果使用傳統(tǒng)的基于連接酶的方法以多個片段構(gòu)建該結(jié)構(gòu)域又沒有合適的限制酶位點。相反，應(yīng)用In-Fusion技術(shù)可以把該結(jié)構(gòu)域的兩段序列合成后在一個反應(yīng)中完成克隆，無需擔心限制酶位點的兼容性。將全長序列無縫克隆到表達載體中，通過限制酶消化和Sanger測序鑒定陽性克隆。最終載體構(gòu)建在三天內(nèi)完成，手動操作時間總計僅兩個多小時。 |
| 【用戶感言】 |
| “In-Fusion克隆的速度、準確性和易用性使我確信再次購買該產(chǎn)品。” -Christian Joerg Braun |
| 【實驗結(jié)果】 |
| 通過單酶切將準備好的Cas9表達構(gòu)建體線性化并凝膠純化。設(shè)計兩個合成的插入片段，使片段末端之間以及和載體末端帶有重疊的區(qū)域。將兩個插入片段同時克隆到線性化的表達載體中，并用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化附帶的感受態(tài)細胞。通過限制酶消化進行菌落篩選，并通過測序進一步確認陽性克隆。在篩選的9個菌落中，6個顯示正確的酶切結(jié)果（下圖）和測序結(jié)果。 |
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| 圖1. 酶切確認陽性克隆。通過EcoR I酶切進行轉(zhuǎn)化菌落的篩選。結(jié)果顯示在檢測的9個菌落中有6個陽性菌落。3個陰性菌落是載體自連。數(shù)據(jù)圖片由Christian Braun提供。 |
| 【用戶感言】 |
| “我沒有嘗試過任何其他克隆方法用于本實驗，而是直接測試了In-Fusion克隆方法。限制酶位點的可用性是這個實驗的一個問題，我很高興In-Fusion克隆不需要依賴限制酶位點。” -Christian Joerg Braun |
| 【結(jié)論】 |
| 利用In-Fusion技術(shù)，僅通過一個克隆反應(yīng)就將兩個合成的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域序列克隆到Cas9表達載體中，成功率為～67％。激活結(jié)構(gòu)域二級結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致無法進行全長序列合成，而將序列分成兩部分又沒有合適的酶切位點，無法使用傳統(tǒng)連接酶方法進行克隆。In-Fusion Cloning能夠在三天內(nèi)生成最終的陽性克隆，無需被限制酶位點或后續(xù)的一系列克隆反應(yīng)所困擾。 |
| 詳細實驗方法和步驟請見： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/solve-a-synthesis-challenge-with-easy-multiple-insert-cloning |
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